Le criblage automatisé permet d'évaluer l'activité d'un grand nombre de composés chimiques ou naturels sur des cibles biologiques (macromolécules, cellules,organes, tissus, animaux). Il nécessite le développement d'essais miniaturisés et leur automatisation sur une plateforme robotique.
Introduction / Principe
Le suivi de la cicatrisation cellulaire est effectué par un automate de microscopie : l'IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE) (quantification de la confluence cellulaire).
Protocole
Format : 24 puits ou 96 puits
Réalisation de la blessure du tapis cellulaire à confluence avec un « WoundMaker » (ESSEN INSTRUMENT).
Suivi de la cicatrisation cellulaire au niveau de la blessure au cours du temps en présence ou en absence de molécules d'intérêt et/ou de facteurs trophiques.
WoundMaker 24 puits "Pin block" 96 puits
WoundMaker (ESSEN INSTRUMENT)
Suivi de la cicatrisation sur des cellules HaCaT
Les criblages moléculaires sur cibles purifiées visent typiquement à (1) modifier des interactions entre des cibles biologiques ou (2) modifier l'activité d'une cible biologique (enzyme par exemple).
1) Exemples de tests d'interactions :
2) Exemples de tests fonctionnels
Les criblages phénotypiques visent à modifier un phénotype sans nécessairement connaître la cible biologique responsable de ce phénotype.
Ils sont principalement réalisés sur des cellules vivantes ou fixées en utilisant, soit :
Les cribles phénotypiques peuvent également être réalisés sur des organismes vivants unicellulaires (bactérie, levure, champignon) à haut débit, ou sur des organismes vivants complexes (nématode, ascidie, drosophile, poisson zèbre,...) à des débits adaptés à chaque organisme.
A titre d'exemple, les essais phénotypiques sur cellules vivantes ou fixées en HTS ou HCS disponibles sont listés ci-dessous. De nouveaux tests personnalisés peuvent être développés en collaboration avec l'infrastructure (cf « Miniaturisation d'essais ») :
Mesure de la liaison récepteur-ligand sur cellules entières sans marquage
Introduction
Le test cellulaire Label Free, issu de la technologie Corning Epic®, permet de mesurer les changements phénotypiques des cellules entières suite à un stimulus engendrant une redistribution dynamique de masse de la cellule (DMR) .
La redistribution dynamique de masse de la cellule en réponse à un stimulus a lieu dans la majorité des évènements biologiques, et sa mesure peut être réalisée dans le cadre de nombreuses applications, comme la liaison d'un ligand, l'activation ou l'inhibition d'un récepteur, le recrutement intracellulaire, la cytotoxicité, l'infection virale, l'endocytose, le chimiotactisme...
Principe
Les cellules sont ensemencées dans des plaques au fond desquelles sont disposés des biosenseurs optiques. Le fond de la plaque est éclairé par de la lumière large bande, et la redistribution de masse des cellules suite à un stimulus engendre une modification de l'indice de réfraction de la monocouche cellulaire. Ce changement d'indice est détecté par les biosenseurs, et se traduit par une variation en pm (picomètres) de longueur d'onde de la lumière réfractée.
Protocole
A adapter en fonction de l'essai Format : 384 puits Cellules : cellules adhérentes
Mesure de DMR sur cellules HEK surexprimant le récepteur de l'ocytocine
1) Mesure de l'effet agoniste de l'ocytocine
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine
2) Mesure de l'effet antagoniste du L-368,899
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine
En présence de 30 nM d'ocytocine
Mesure de l'AMPc intracellulaire
Introduction
L'adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique (AMPc) est un des plus importants seconds messagers, intervenant dans les réponses physiologiques de neurotransmetteurs, hormones et médicaments.
L' AMPc est produit à partir d'adénosine triphosphate (ATP) par l'adénylate cyclase membranaire. La régulation de la concentration intracellulaire en AMPc est contrôlée par l'équilibre entre sa synthèse à partir d'ATP et sa dégradation rapide en 5'-AMP par une phosphodiestérase (PDE).
Certains récepteurs RCPG peuvent contrôler la production d'AMPc en agissant via l'activation de protéines G spécifiques, capables de stimuler (Gs) ou d'inhiber (Gi) sa production.
La mesure de l'AMPc intracellulaire est donc une méthode permettant de mesurer l'effet de composés sur certains RCPG.
Principe
L'essai est basé sur la compétition entre l'AMPc traceur marqué avec l'europium et l'AMPc de l'échantillon pour la liaison sur à des anticorps anti-cAMP marqués avec le colorant ULight TM. En l'absence d'AMPc libre, les anticorps se lient à l'AMPc traceur, l'énergie émise par l'europium excité à 320 ou 340nm est transférée par FRET aux molécules ULightTM qui émettent à 665nm, le signal TR-FRET est maximal. En présence d'AMPc libre, il y a compétition pour la liaison aux anticorps, le signal TR-FRET est donc diminué.
Protocole
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres cellules)
Récepteur : RCPG couplé Gαs
Longueur d'onde d'excitation : 320 nm
Longueur d'onde d'emission 1 : 615 nm
Longueur d'onde d'emission 2 : 665 nm
Stimulation du récepteur à la vasopressine et mesure du signal AMPc associé
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surrexprimant le récepteur à la vasopressine AVPR2
Dosage de l'IP1 intracellulaire
IntroductionLa détection des seconds messagers intracellulaires comme l'IP1, produit suite à l'activation des récepteurs couplés aux protéines Gq, peut être réalisée par la technologie HTRF®.
La technologie HTRF® (http://www.cisbio.com/) repose sur le principe de base du FRET. Les propriétés des fluorophores utilisés apportent de nombreux avantages.
Principe
Il s'agit d'un test de compétition pour la liaison à un anticorps anti-IP1 lié au fluorophore donneur, entre d'une part l'IP1 intracellulaire et d'autre part l'IP1 apporté par le kit fusionné au fluorophore accepteur.
Du LiCl est ajouté dans le tampon de réaction pour permettre l'accumulation de l'IP1 produit dans les cellules.
Protocole
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres lignées)
Longueur d'onde d'excitation : 337 nm
Longueur d'onde d'emission 1 : 665 nm (émission du fluorophore donneur)
Longueur d'onde d'emission 2 : 615 nm (émission du fluorophore accepteur)
Dosage de l'IP1 intracellulaire suite à la stimulation du récepteur de l'ocytocine
Cellules HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine Analyse : S = Signal 665 nm / Signal 615 nm1)Courbe standard
2)Mesure de l'effet agoniste de l'ocytocine et de la carbétocine
3)Mesure de l'effet antagoniste du composé L-869,899 en présence de 30 nM d'agoniste
Mesure de flux calcique intracellulaire
Introduction
Le calcium est impliqué dans de nombreux processus physiologiques (libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire, coagulation sanguine...) et dans la signalisation cellulaire où il agit comme un second messager suite à l'activation des protéines hétérotrimériques Gq via les récepteurs couplés aux protéines G.
Ce test permet de suivre de manière dynamique les variations de concentration intracytoplasmique de calcium sur des cellules vivantes.
Principe
Les mesures de flux calciques sont réalisées via l'utilisation d'une sonde fluorescente sensible au calcium (Indo1 ou Fluo4). Selon la nature de la sonde, sa liaison avec le calcium induit une variation de son intensité de fluorescence et éventuellement un déplacement de son spectre d'émission :
Les sondes sont rendues perméantes par l'ajout d'un groupement acétométhylester (AM), et peuvent ainsi sous cette forme passer la membrane plasmique des cellules. La partie AM est libérée à l'intérieur de la cellule par des estérases intracellulaires .
Les mesures sont réalisées sur un lecteur semi-robotisé (Flexstation3® Molecular Devices) qui permet de détecter en temps réel la libération de calcium intracellulaire.
Protocole
Sonde calcique :
Indo1-AM ((λex338nm / (λem1401nm, (λem2475nm)
Fluo4-AM ((λex494nm / (λem516nm)
Format : 96 ou 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres lignées)
1)Chargement des cellules avec la sonde
2)Décollement des cellules et distribution dans la plaque
3)Mesure du signal de base
4)Traitement des cellules avec les composés d'intérêt + mesure
Possibilité de faire jusqu'à 3 traitements consécutifs.
Stimulation du récepteur de l'ocytocine et mesure du signal calcique associé
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant de récepteur de l'ocytocine
Dosage de la sécrétion de cytokines par des cellules mononucléées humaines
Introduction
Les cytokines, sécrétées par les cellules effectrices du système immunitaire, ont un rôle majeur dans la plupart des maladies inflammatoires chroniques.
Leur dosage constitue donc une cible biologique pertinente dans la recherche d'actifs anti-inflammatoires.
Principe
Le dosage de cytokines sécrétées par des cellules mononucléées humaines peut être réalisé par test immuno enzymatique ELISA ou avec la technologie HTRF.
1. ELISA
Les protéines à doser, liées à un anticorps de capture sont détectées par un complexe biotine-streptavidine couplé à la peroxidase, qui en présence de son substrat permet le développement d'une réaction colorimétrique quantifiée par mesure d'absorbance à 450 nm. L'absorbance mesurée est proportionnelle à la concentration de la cytokine dosée.
2. HTRF (CISBIO INTERNATIONAL)
Deux fluorophores partenaires donneur (cryptate d'europium) / accepteur (XL665) sont fusionnés respectivement à un anticorps spécifique de la protéine à doser. Le transfert d'énergie en temps retardé (TR-FRET) entre le couple de fluorophores est proportionnel à la concentration en cytokine dosée présente dans l'échantillon.
www.cisbio.com. Cet essai est homogène et ne nécessite que de faibles quantités de protéines
Protocole
Cellules mononucléées isolées à partir de sang périphérique humain
1. Traitement
Formats: 24 ou 96 puits
Stimulation: 5 µg/mL LPS ou 5 µg/mL PHA
Molécules de référence: Dexamethasone ; Rolipram
Incubation : 24H à 37°C sous 5% CO2.
2. Révélation
Dosage ELISA : Format 96 puits / mesure d'absorbance à 450 nm
Dosage HTRF: Format 384 puits
Longueur d'onde d'excitation : 337 nm
Longueur d'onde d'émission 1 : 615 nm (émission du fluorophore donneur)
Longueur d'onde d'émission 2 : 665 nm (émission du fluorophore accepteur)
Sécrétion de TNF-α par des cellules mononucléées humaines en présence de composés anti-inflammatoires
Les dosages du TNF-α, de l'IL1-ß, de l'IL-6 et de l'IL-8 ont été développés par ELISA. Les dosages du TNF-α, de l'IL1-ß, de l'IL-6, de l'IL-8, de l'IL-10 et de l'INF-γ ont été développés par HTRF.
D'autres cytokines peuvent être testées sur demande.
Demande de projet
Introduction
Le test biochimique Label Free, issu de la technologie Corning Epic®, permet de mesurer, sans aucun marquage, la liaison d'un ligand sur une cible protéique.
Principe
La protéine cible est immobilisée dans des plaques au fond desquelles sont disposés des biosenseurs optiques.
Pour les liaisons plus difficiles à détecter, il est possible d'ajouter un espaceur pour rendre la protéine plus accessible.
Le fond de la plaque est éclairé par de la lumière large bande, et les modifications de masse liées à la fixation d'un ligand à la protéine cible engendrent une modification de l'indice de réfraction de la lumière réfractée. Ce changement d'indice est détecté par les biosenseurs, et se traduit par une variation en pm (picomètres) de longueur d'onde de la lumière réfractée. Une zone de référence dans le puits empêche l'immobilisation de la cible, et permet ainsi de générer des résultats qui ne représentent que les effets de la liaison du ligand sur la protéine.
Protocole
A adapter en fonction de l'essai
Format : 384 puits
Plaques pré-activées ou activées par l'opérateur
Mesure de la liaison de la biotine sur la streptavidine par la technologie label free
Plaques pré-activées
Streptavidine 75 µg/mL
Biotine : 25 nM à 40 µM
Nous proposons un accompagnement et une étude préalable de faisabilité pour miniaturiser les essais afin de les rendre compatibles avec la technologie du criblage à haut débit tout en réduisant les coûts et en augmentant leur robustesse statistique.
Les essais sont miniaturisés au format de microplaques (96 ou 384 puits le plus souvent) et la procédure expérimentale est adaptée afin de permettre le traitement des échantillons par des robots de pipetage et de réaliser le criblage d'un grand nombre de composés (seuls ou en combinaison). Les effets biologiques sont quantifiés par diverses mesures de fluorescences, luminescence, radioactivité ou imagerie.
Demande de projet
Suivi de la croissance d'une souche bactérienne
Introduction / Principe
Cet essai permet d'identifier de potentiels inhibiteurs de la croissance bactérienne.
La croissance d'une souche bactérienne est suivie sur plusieurs heures par turbidimétrie en présence des molécules à tester.
La concentration bactérienne est proportionnelle à l'absorbance mesurée à 620 nm.
Protocole
Format: 96 puits
Souche bactérienne: A définir
Concentration des molécules à tester: A définir
Incubation : A définir
Mesure de la densité optique à 620 nm en fonction du temps
Evaluation des effets cytotoxiques d'un composé
Introduction
L'étude de la cytotoxicité d'un composé ayant une activité modulatrice sur la réponse des cellules est essentielle.
Elle permet de vérifier que la molécule active n'induit aucune modification de la viabilité cellulaire par rapport aux cellules non traitées.
Plusieurs lignées cellulaires sont disponibles pour l'étude de la cytotoxicité
Principe
Plusieurs tests de viabilité cellulaire sont proposés
1. Test MTT
Le test est basé sur
le clivage par la succinate deshydrogénase mitochondriale d'un sel de tétrazolium de couleur jaune en
cristaux de formazan de couleur bleue.
La réaction est quantifiée par mesure de l'absorbance à 560 nm des cristaux solubilisés
dans un solvant organique qui est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.
2. Test WST-1 www.ozyme.fr
Le test est basé sur le clivage par la succinate deshydrogénase mitochondriale d'un sel de tétrazolium de couleur rouge en
cristaux de formazan de couleur jaune.
La
réaction est quantifiée par mesure de l'absorbance à 450 nm des cristaux solubles dans le milieu de
culture qui est proportionnelle au
nombre de cellules vivantes.
A la différence du MTT, le WST-1 est un sel de tétrazolium capable d'être clivé par les cellules vivantes en formazan soluble, il n'y a donc pas d'étape de solubilisation ultérieure dans un solvant organique.
3. Test Cell Titer Glo Luminescent (PROMEGA) www.promega.com
Le test est basé sur la mono oxygénation de la luciférine en oxyluciférine par la luciférase en présence de Mg 2+ et d'ATP La réaction est quantifiée par mesure du signal luminescent qui est proportionnel à l'ATP présent dans le milieu et donc à l'activité métabolique des cellules.
4. IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE) www.essenbioscience.com
Cet appareil permet
de, réaliser des cinétiques de la
prolifération cellulaire dans des
conditions de culture classiques sous atmosphère contrôlée en quantifiant la confluence des cellules.
Protocole
Format: 96 ou 384 puits
Ensemencement des cellules 24H avant traitement
Molécule de référence : Chlorpromazine
Incubation 48H à 37°C (possibilité d'adapter le temps d'incubation au modèle biologique)
Réalisation du test de viabilité cellulaire
Evaluation de la cytotoxicité de la Chlorpromazine sur HepG2 (ATCC HB-8065)
IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE)
Les protéines kinases sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires, généralement en réponse à un stimuli externe. Cette famille d'enzymes est devenue une des principales sources de cibles pour le développement de médicaments. Le nombre de petites molécules inhibitrices de protéines kinases (PKIs) approuvées continue d'augmenter. Plus de 50+ médicaments sont arrivés sur le marché américain, dont 85% sont utilisés pour le traitement de tumeurs cancéreuses. Actuellement, dans le monde, plus de 200 PKIs efficaces par voie orale sont en essai clinique (une liste complète, régulièrement mise à jour, des PKIs en essai cliniques est disponible à cette adresse www.icoa.fr/pkidb/).
Des composés chimiques naturels ou synthétiques, ainsi que des fractions semi-purifiées d'extraits naturels, peuvent être analysés par l'infrastructure ChemBioFrance pour découvrir de nouveaux PKIs. Une étude structure-activité peut être réalisée pour identifier un composé "lead". Le mode de liaison, du composé hit à sa cible kinase, peut également être évalué par un test de compétition à l'ATP.
Essai kinase :
Les activités enzymatiques des kinases sont analysées en plaques 384 puits à l'aide du kit ADP-GloTM (Promega, Madison, WI). Ce test de détection de l'ADP par luminescence, fournit une méthode de criblage, homogène et à haut débit, permettant de mesurer l'activité kinase par évaluation de la quantité d'ADP produite au court de la réaction kinase.
Les réactions sont effectuées dans un volume final de 6 µl pendant 30 min. à 30°C en tampon kinase approprié, contenant le substrat (une protéine ou un peptide), et en présence de 10 µM d'ATP. La réaction kinase est arrêtée par addition de 6 µl d'ADP-GloTM Kinase Reagent. Après une incubation de 50 min. à température ambiante (RT), 12 µl du réactif Kinase Detection Reagent sont ajoutés. Le signal émis est mesuré, après une heure d'incubation à RT, à l'aide d'un luminomètre pour microplaque Envision (PerkinElmer, Waltham, MA), et est exprimé en Unité Lumineuse Relative (RLU). Les activités kinases sont exprimées en % de l'activité maximale, c'est-à-dire l'activité mesurée en absence d'inhibiteur.
*(A) Criblage primaire sur kinase et * (B) Détermination d'IC50
(A) Les composés sont tout d'abord testés à deux concentrations (1 µM and 10 µM) sur un panel de kinases d'intérêt thérapeutique. (B) Les composés induisant, à 1 ou 10 µM, plus de 50% d'inhibition de l'activité kinase sont ensuite testés sur les kinases concernées. Une large gamme de concentrations (généralement de 0,0003 à 10 µM) est alors testée, en duplicat, et les valeurs d'IC50 sont déterminées à partir des courbes dose-réponse réalisées sous GaphPad Prism.
Criblage primaire d'une collection chimique
Détermination d'IC50
* Test de compétition ATP par la méthode ADP-GloTM
L'étude du mécanisme d'inhibition des composés hits, est réalisée par des expériences de cinétique en faisant varier à la fois les niveaux d'ATP et les concentrations d'inhibiteur. L'analyse des résultats est faite par représentation de la double-réciproque de l'équation de Michaelis-Menten (aussi connue sous le nom de Lineweaver-Burk).
Panel de kinases
A titre d'exemples, les kinases à tester peuvent être sélectionnées au sein de cette liste de cibles déjà étudiées au sein de l'infrastructure ChemBioFrance : 1. CDK2/CyclinA (CMGC), 2. CDK5/p25 (CMGC), 3. CDK9/CyclinT (CMGC), 4. CDK10/CyclinM (CMGC), 5. GSK3α (CMGC), 6. GSK3ß (CMGC), 7. CLK1 (CMGC), 8. DYRK1A (CMGC), 9. PIM1 (CAMK), 10. CK1ε (CK1), 11. NEK6 (Autre), 12. NEK7 (Autre), 13. ABL1 (TK), 14. EGFR (TK), 15. VEGFR-2 (TK), 16. JAK3 (TK), 17. Haspin (Autre), 18. RIPK3 (TKL), 19. PfGSK3 (de Plasmodium falciparum), 20. LmCK1 (de Leishmania major).
Le panel de kinases disponibles est indiqué sur la représentation du kinome humain.
Les codes présentés sur cette figure indiquent les sous-classes de protéines kinases : CMGC pour CDKs, MAP kinases, GSK, et les kinases apparentées aux CDKs ; AGC pour les familles de protéines kinases A, C, et G (PKA, PKC, PKG) ; CAMK pour les protéines kinases Ca2+/calmoduline-dépendantes ; CK1, Cell/Caséine Kinase 1 ; STE, STE Kinases (Homologues des kinases STErile de levure) ; TKL, Tyrosine Kinases-Like ; TK, Tyrosine Kinases.
Chaque essai kinase est validé à l'aide d'inhibiteurs modèles de référence, utilisés dans les mêmes conditions que les composés testés. Par exemple : l'Indirubin-3'-oxime pour CDK2/CyclinA, CDK5/p25, CDK9/CyclinT, RnDYRK1A et MmCLK1 ; SGI-1776 pour Pim1 ; Staurosporine de Streptomyces sp. pour CK1ε ; Tofacitinib pour JAK3; Imatinib mesylate pour ABL1 ; CHR-6494 pour HASPIN ; et GSK'872 pour RIPK3.
Demande de projet