Le criblage automatisé permet d'évaluer l'activité d'un grand nombre de composés chimiques ou naturels sur des cibles biologiques (macromolécules, cellules,organes, tissus, animaux). Il nécessite le développement d'essais miniaturisés et leur automatisation sur une plateforme robotique.
Introduction / Principe
Le suivi de la cicatrisation cellulaire est effectué par un automate de microscopie : l'IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE) (quantification de la confluence cellulaire).
Protocole
Format : 24 puits ou 96 puits
Réalisation de la blessure du tapis cellulaire à confluence avec un « WoundMaker » (ESSEN INSTRUMENT).
Suivi de la cicatrisation cellulaire au niveau de la blessure au cours du temps en présence ou en absence de molécules d'intérêt et/ou de facteurs trophiques.
WoundMaker 24 puits "Pin block" 96 puits
WoundMaker (ESSEN INSTRUMENT)
Suivi de la cicatrisation sur des cellules HaCaT
Les criblages moléculaires sur cibles purifiées visent typiquement à (1) modifier des interactions entre des cibles biologiques ou (2) modifier l'activité d'une cible biologique (enzyme par exemple).
1) Exemples de tests d'interactions :
2) Exemples de tests fonctionnels
Les criblages phénotypiques visent à modifier un phénotype sans nécessairement connaître la cible biologique responsable de ce phénotype.
Ils sont principalement réalisés sur des cellules vivantes ou fixées en utilisant, soit :
Les cribles phénotypiques peuvent également être réalisés sur des organismes vivants unicellulaires (bactérie, levure, champignon) à haut débit, ou sur des organismes vivants complexes (nématode, ascidie, drosophile, poisson zèbre,...) à des débits adaptés à chaque organisme.
A titre d'exemple, les essais phénotypiques sur cellules vivantes ou fixées en HTS ou HCS disponibles sont listés ci-dessous. De nouveaux tests personnalisés peuvent être développés en collaboration avec l'infrastructure (cf « Miniaturisation d'essais ») :
Mesure de la liaison récepteur-ligand sur cellules entières sans marquage
Introduction
Le test cellulaire Label Free, issu de la technologie Corning Epic®, permet de mesurer les changements phénotypiques des cellules entières suite à un stimulus engendrant une redistribution dynamique de masse de la cellule (DMR) .
La redistribution dynamique de masse de la cellule en réponse à un stimulus a lieu dans la majorité des évènements biologiques, et sa mesure peut être réalisée dans le cadre de nombreuses applications, comme la liaison d'un ligand, l'activation ou l'inhibition d'un récepteur, le recrutement intracellulaire, la cytotoxicité, l'infection virale, l'endocytose, le chimiotactisme...
Principe
Les cellules sont ensemencées dans des plaques au fond desquelles sont disposés des biosenseurs optiques. Le fond de la plaque est éclairé par de la lumière large bande, et la redistribution de masse des cellules suite à un stimulus engendre une modification de l'indice de réfraction de la monocouche cellulaire. Ce changement d'indice est détecté par les biosenseurs, et se traduit par une variation en pm (picomètres) de longueur d'onde de la lumière réfractée.
Protocole
A adapter en fonction de l'essai Format : 384 puits Cellules : cellules adhérentes
Mesure de DMR sur cellules HEK surexprimant le récepteur de l'ocytocine
1) Mesure de l'effet agoniste de l'ocytocine
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine
2) Mesure de l'effet antagoniste du L-368,899
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine
En présence de 30 nM d'ocytocine
Mesure de l'AMPc intracellulaire
Introduction
L'adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique (AMPc) est un des plus importants seconds messagers, intervenant dans les réponses physiologiques de neurotransmetteurs, hormones et médicaments.
L' AMPc est produit à partir d'adénosine triphosphate (ATP) par l'adénylate cyclase membranaire. La régulation de la concentration intracellulaire en AMPc est contrôlée par l'équilibre entre sa synthèse à partir d'ATP et sa dégradation rapide en 5'-AMP par une phosphodiestérase (PDE).
Certains récepteurs RCPG peuvent contrôler la production d'AMPc en agissant via l'activation de protéines G spécifiques, capables de stimuler (Gs) ou d'inhiber (Gi) sa production.
La mesure de l'AMPc intracellulaire est donc une méthode permettant de mesurer l'effet de composés sur certains RCPG.
Principe
L'essai est basé sur la compétition entre l'AMPc traceur marqué avec l'europium et l'AMPc de l'échantillon pour la liaison sur à des anticorps anti-cAMP marqués avec le colorant ULight TM. En l'absence d'AMPc libre, les anticorps se lient à l'AMPc traceur, l'énergie émise par l'europium excité à 320 ou 340nm est transférée par FRET aux molécules ULightTM qui émettent à 665nm, le signal TR-FRET est maximal. En présence d'AMPc libre, il y a compétition pour la liaison aux anticorps, le signal TR-FRET est donc diminué.
Protocole
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres cellules)
Récepteur : RCPG couplé Gαs
Longueur d'onde d'excitation : 320 nm
Longueur d'onde d'emission 1 : 615 nm
Longueur d'onde d'emission 2 : 665 nm
Stimulation du récepteur à la vasopressine et mesure du signal AMPc associé
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surrexprimant le récepteur à la vasopressine AVPR2
Dosage de l'IP1 intracellulaire
IntroductionLa détection des seconds messagers intracellulaires comme l'IP1, produit suite à l'activation des récepteurs couplés aux protéines Gq, peut être réalisée par la technologie HTRF®.
La technologie HTRF® (http://www.cisbio.com/) repose sur le principe de base du FRET. Les propriétés des fluorophores utilisés apportent de nombreux avantages.
Principe
Il s'agit d'un test de compétition pour la liaison à un anticorps anti-IP1 lié au fluorophore donneur, entre d'une part l'IP1 intracellulaire et d'autre part l'IP1 apporté par le kit fusionné au fluorophore accepteur.
Du LiCl est ajouté dans le tampon de réaction pour permettre l'accumulation de l'IP1 produit dans les cellules.
Protocole
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres lignées)
Longueur d'onde d'excitation : 337 nm
Longueur d'onde d'emission 1 : 665 nm (émission du fluorophore donneur)
Longueur d'onde d'emission 2 : 615 nm (émission du fluorophore accepteur)
Dosage de l'IP1 intracellulaire suite à la stimulation du récepteur de l'ocytocine
Cellules HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine Analyse : S = Signal 665 nm / Signal 615 nm1)Courbe standard
2)Mesure de l'effet agoniste de l'ocytocine et de la carbétocine
3)Mesure de l'effet antagoniste du composé L-869,899 en présence de 30 nM d'agoniste
Mesure de flux calcique intracellulaire
Introduction
Le calcium est impliqué dans de nombreux processus physiologiques (libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire, coagulation sanguine...) et dans la signalisation cellulaire où il agit comme un second messager suite à l'activation des protéines hétérotrimériques Gq via les récepteurs couplés aux protéines G.
Ce test permet de suivre de manière dynamique les variations de concentration intracytoplasmique de calcium sur des cellules vivantes.
Principe
Les mesures de flux calciques sont réalisées via l'utilisation d'une sonde fluorescente sensible au calcium (Indo1 ou Fluo4). Selon la nature de la sonde, sa liaison avec le calcium induit une variation de son intensité de fluorescence et éventuellement un déplacement de son spectre d'émission :
Les sondes sont rendues perméantes par l'ajout d'un groupement acétométhylester (AM), et peuvent ainsi sous cette forme passer la membrane plasmique des cellules. La partie AM est libérée à l'intérieur de la cellule par des estérases intracellulaires .
Les mesures sont réalisées sur un lecteur semi-robotisé (Flexstation3® Molecular Devices) qui permet de détecter en temps réel la libération de calcium intracellulaire.
Protocole
Sonde calcique :
Indo1-AM ((λex338nm / (λem1401nm, (λem2475nm)
Fluo4-AM ((λex494nm / (λem516nm)
Format : 96 ou 384 puits
Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d'autres lignées)
1)Chargement des cellules avec la sonde
2)Décollement des cellules et distribution dans la plaque
3)Mesure du signal de base
4)Traitement des cellules avec les composés d'intérêt + mesure
Possibilité de faire jusqu'à 3 traitements consécutifs.
Stimulation du récepteur de l'ocytocine et mesure du signal calcique associé
Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant de récepteur de l'ocytocine
Dosage de la sécrétion de cytokines par des cellules mononucléées humaines
Introduction
Les cytokines, sécrétées par les cellules effectrices du système immunitaire, ont un rôle majeur dans la plupart des maladies inflammatoires chroniques.
Leur dosage constitue donc une cible biologique pertinente dans la recherche d'actifs anti-inflammatoires.
Principe
Le dosage de cytokines sécrétées par des cellules mononucléées humaines peut être réalisé par test immuno enzymatique ELISA ou avec la technologie HTRF.
1. ELISA
Les protéines à doser, liées à un anticorps de capture sont détectées par un complexe biotine-streptavidine couplé à la peroxidase, qui en présence de son substrat permet le développement d'une réaction colorimétrique quantifiée par mesure d'absorbance à 450 nm. L'absorbance mesurée est proportionnelle à la concentration de la cytokine dosée.
2. HTRF (CISBIO INTERNATIONAL)